蛋白质层析纯化时缓冲液的选择

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概述

建立蛋白质层析纯化工艺时，最重要的是需要考虑纯化得到的蛋白质应能满足其后续应用要求。蛋白质的数量及纯度都必须满足实验分析要求。而且，因为后续研究需要的是保持良好折叠结构的活性蛋白质，因此蛋白质行为的相关信息也需要考虑。在纯化及后续的保存过程中，很多处理方法都会对蛋白质的性质产生影响，如蛋白质的去折叠、聚集、降解和失活等。制定详细计划，在最短时间内完成蛋白质纯化，并在最稳定的条件下进行保存才算是成功地完成了其整个纯化过程。

当我们纯化蛋白时，最重要的就是要保持蛋白在纯化过程中不能去折叠、聚集、降解和失活，或者是尽量降低纯化过程对蛋白活性带来的损失。这就要求蛋白在整个纯化过程中要始终保持可溶性和活性。

在层析工艺缓冲液选择时应考虑以下几个因素：pH值、缓冲体系、添加剂。其中每一个因素都要根据你的目的蛋白进行优化，并以目的蛋白的活性作为优化的评估标准。

pH的选择

在蛋白质层析工艺中，首先我们要考虑蛋白质的pH稳定性和可溶性，一般蛋白质在其pI附近的pH值溶液中容易沉淀。在层析工艺开发前，我们先要验证目标蛋白的pH稳定性。每一种层析介质都有它的工作pH范围，我们在开发层析工艺时，要了解所选择的层析介质的工作pH范围。所以我们设计层析工艺时，同时要考虑蛋白质的pH稳定性范围及层析介质的工作pH范围。

缓冲液体系的选择

每一步纯化过程中，蛋白质的溶液环境对其稳定性和活性的保持都非常关键。蛋白质应该保存在一个良好的缓冲液环境中，要避免突然的pH值变化，以其防止对蛋白质折叠状态、溶解性和活性造成不可逆的影响。

图 1. 含Tris碱及其酸式物的Tris缓冲液溶液。Tris 25°C的pKa值是8.06，表示当pH=8.06，50%的Tris是质子化（酸式结构），50%是去质子化（碱式结构）。

缓冲液是一种含有共轭酸/碱对的水溶液。缓冲液的pH值范围根据其pKa值决定。该pKa值定义为50%的分子为酸式结构，50%为碱式结构时的pH值 （图1）。关于缓冲液的一个常规原则是，其pH值应保证在pKa值左右1个pH值单位范围内，从而保证其具有良好的缓冲能力。如此可以保证同时有足够的以酸式结构和碱式结构存在的分子在加入 H+ 或者 OH- 时可以将它们中和。这样，缓冲液就可以防止pH变化导致的蛋白质稳定性改变。

一种好的缓冲液必须具有以下特征  :

✔水溶性

✔化学稳定性

✔在所需pH范围内良好的缓冲能力

✔与分析和实验应用条件具有良好的兼容性

✔与其他溶质具有良好的兼容性

很多物质都可以用于生物缓冲液。最常使用的缓冲液成分通常具有接近中性的pKa值，可在生理pH值范围左右使用。表1列出了4种最常用的生物缓冲液、各自的pH值应用范围及各自可能对蛋白质纯化过程产生影响的优缺点。为保证足够的缓冲能力，这些缓冲液的浓度通常为25mM。

表一：蛋白质纯化中最常用的生物缓冲液。缓冲液在一定pH值范围内可保持它们的缓冲能力，部分缓冲液成分会对某些层析过程或者分析实验造成影响。

添加剂的选择

    除了一个合适的缓冲液体系，蛋白质纯化过程中——从溶菌到保存——所使用的溶液通常还含有很多其他对蛋白质纯度、稳定性和活性方面均具有一定作用的成分。溶菌缓冲液和纯化工艺的前期步骤中常常会添加蛋白酶抑制剂以防止目标蛋白质被内源性蛋白酶酶解。而纯化工艺的后期一般不用再添加这些蛋白酶抑制剂，因为此时几乎所有的蛋白酶都已经从目标蛋白质分离出去。蛋白质的保存缓冲液中通常要添加金属螯合剂，如EDTA或EGTA。这些金属螯合剂与 Mg2+结合以防止目标蛋白质被所含的金属蛋白酶分解。还有一些其他的添加剂，主要是用来保护蛋白质不被破坏和增强其溶解性。

表二：蛋白质纯化中用于增强蛋白质稳定性的常用添加剂。

   添加剂只在必要时才使用。可能需要多次尝试才能确定某些添加剂是否对一些特定蛋白质的纯化工艺有效。