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超螺旋质粒DNA大规模制备

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  • TA的每日心情
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    发表于 2022-4-27 09:42:20 | 显示全部楼层 |阅读模式
    1.质粒DNA
    质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段,送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中,构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术,转入受体细胞(如大肠杆菌)中,使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达,从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。
    随着mRNA药物,细胞及基因治疗的发展,质粒DNA得到广泛的应用。质粒DNA在mRNA药物生产中作为体外转录的模板,质粒DNA也可作为核酸药物单独使用,也可以作为在重组病毒载体生产中作为病毒包装的原料。质粒DNA的广泛应用使得GMP级别大规模生产需求急速扩增。

    2.粒DNA的生产流程
    1.大肠杆菌发酵:常用BL21用改良TB培养基高密度发酵,通过补料及过程控制,通常培养20-24 h,OD600可到150-180左右。
    2.菌体收集:发酵结束,通过离心的方式收集菌体,常用5000g,15min离心的方式收集菌体。
    3.菌体洗涤:收集到菌体用菌体:生理盐水=1:10的比例重悬,重悬后再次用5000g,15min离心的方式收集菌体。菌体洗涤可有效去除培养基中的物质,此工序在大规模生产中可省略。
    4.菌体重悬:用100mM Tris-HCl pH 7.5 以缓冲液:菌体=5:1的比例重悬菌体。
    5.碱裂解:重悬后的菌液加入0.2M NaOH 1% SDS处理10-15min,注意加入碱后要缓慢搅拌。也可以用比如高压匀浆,反复冻融等方式裂解细胞。
    6.裂解液中和:用3M NaAc pH5.5 中和裂解液,30min。
    7.固液分离:中和后的溶液用8000-10000g ,30min离心的方式收集上清液,去除细胞碎片等固形物。
    8.澄清:离心后的上清液用0.1-0.45um的切向流微滤膜组件澄清处理。
    9.浓缩:澄清后上清液用300KD的切向流超滤膜组件浓缩30-50倍。
    10.层析纯化:
    10.1凝胶过滤层析:用蓝晓科技Seplife 6FF纯化,此过程主要去除RNA,质粒分子量大,流经柱床时,质粒DNA被排阻在填料孔外,而RNA进入到填料孔内实现分离。通常柱高建议在50-80cm的高度,上样量在0.2-0.3CV之间,推荐线性流速60-100 cm/h。➤Buffer:2.1M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5

    图片1.png
    图片2.png
    结果:Seplife 6FF柱纯化后,样品去除RNA≥95%,scDNA回收率≥95%。
    10.2. 亲和层析:去除RNA的scDNA溶液中还含有一定量的ocDNA等杂质,蓝晓科技Seplife Plasmid LX填料特异性的结合scDNA,溶液经Seplife Plasmid LX柱床scDNA结合在填料上,ocDNA流穿,再将scDNA从柱床上洗脱下来实现分离。
    ➤平衡缓冲液:2.0M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
    ➤洗脱缓冲液:0.3M NaCl,1.7M(NH4)2SO4,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
    图片3.png
    图片4.png
    图片5.png

    结果:Seplife Plasmid LX 填料纯化质粒样品可实现对ocDNA和scDNA的完全分离,而且scDNA纯度可以达到≥95%(重复三次)
    ➤经过系统测试Seplife Plasmid LX填料结合scDNA的最大载量为9.12 mg/mL(填料)。更多信息请联系蓝晓科技。5min保留时间,载量≥3mg/ml(填料),与实验条件,样品浓度等有关。
    10.3离子交换层析:经过Seplife 6FF和Seplife Plasmidl LX纯化后的scDNA内毒素含量已经很低,再经Seplife LXMS-30Q进一步纯化,将痕量的内毒素去除。
    ➤推荐平衡缓冲液:0.4M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
    ➤推荐洗脱缓冲液:1.0M NaCl,10mM EDTA,100mM Tris-HCl,pH 7.5
    图片6.png
    结果:经过前2步层析后的scDNA样品经Seplife LXMS-30 Q填料纯化后回收率为94.6%,内毒素含量1.2EU/mg(scDNA)。
    ➤此工序的离子交换填料Seplife LXMS-30Q也可以尝试用蓝晓科技高刚性高分辨率高回收率多糖材质填料Q Large Scale HP替换,可根据实际情况合理选择。
    11. 纯化scDNA在经过超滤伴随洗滤的方式调整浓度及置换缓冲液,再除菌过滤后进入后续制剂或者酶切工序。

    3.质粒DNA其它纯化工艺
    澄清并浓缩的质粒也可以用4M CaCl2等进行进行盐析,去除RNA,也可以用多模式填料Seplife Suncore 700填料流穿模式去除RNA等杂质,再配合Seplife Plasmidl LX亲和层析或者疏水层析去除ocDNA及内毒素等杂质。
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