超螺旋质粒DNA大规模制备

lemon

1.质粒DNA

质粒是DNA重组技术中常用的载体。载体是指把一个有用的外源基因通过基因工程手段，送进受体细胞中去进行增殖和表达的工具。将某种目标基因片段重组到质粒中，构成重组基因或重组体。然后将这种重组体经微生物学的转化技术，转入受体细胞(如大肠杆菌)中，使重组体中的目标基因在受体菌中得以繁殖或表达，从而改变寄主细胞原有的性状或产生新的物质。

随着mRNA药物，细胞及基因治疗的发展，质粒DNA得到广泛的应用。质粒DNA在mRNA药物生产中作为体外转录的模板，质粒DNA也可作为核酸药物单独使用，也可以作为在重组病毒载体生产中作为病毒包装的原料。质粒DNA的广泛应用使得GMP级别大规模生产需求急速扩增。

2.质粒DNA的生产流程

1.大肠杆菌发酵：常用BL21用改良TB培养基高密度发酵，通过补料及过程控制，通常培养20-24 h，OD600可到150-180左右。

2.菌体收集：发酵结束，通过离心的方式收集菌体，常用5000g,15min离心的方式收集菌体。

3.菌体洗涤：收集到菌体用菌体：生理盐水=1：10的比例重悬，重悬后再次用5000g,15min离心的方式收集菌体。菌体洗涤可有效去除培养基中的物质，此工序在大规模生产中可省略。

4.菌体重悬：用100mM Tris-HCl pH 7.5 以缓冲液：菌体=5:1的比例重悬菌体。

5.碱裂解：重悬后的菌液加入0.2M NaOH 1% SDS处理10-15min，注意加入碱后要缓慢搅拌。也可以用比如高压匀浆，反复冻融等方式裂解细胞。

6.裂解液中和：用3M NaAc pH5.5 中和裂解液，30min。

7.固液分离：中和后的溶液用8000-10000g ，30min离心的方式收集上清液，去除细胞碎片等固形物。

8.澄清：离心后的上清液用0.1-0.45um的切向流微滤膜组件澄清处理。

9.浓缩：澄清后上清液用300KD的切向流超滤膜组件浓缩30-50倍。

10.层析纯化：

10.1凝胶过滤层析：用蓝晓科技Seplife 6FF纯化，此过程主要去除RNA，质粒分子量大，流经柱床时，质粒DNA被排阻在填料孔外，而RNA进入到填料孔内实现分离。通常柱高建议在50-80cm的高度，上样量在0.2-0.3CV之间，推荐线性流速60-100 cm/h。➤Buffer：2.1M（NH4）2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5

结果：Seplife 6FF柱纯化后，样品去除RNA≥95%，scDNA回收率≥95%。

10.2. 亲和层析：去除RNA的scDNA溶液中还含有一定量的ocDNA等杂质，蓝晓科技Seplife Plasmid LX填料特异性的结合scDNA,溶液经Seplife Plasmid LX柱床scDNA结合在填料上，ocDNA流穿，再将scDNA从柱床上洗脱下来实现分离。

➤平衡缓冲液：2.0M（NH4）2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5

➤洗脱缓冲液：0.3M NaCl，1.7M（NH4）2SO4，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5

结果：Seplife Plasmid LX 填料纯化质粒样品可实现对ocDNA和scDNA的完全分离，而且scDNA纯度可以达到≥95%（重复三次）。

➤经过系统测试Seplife Plasmid LX填料结合scDNA的最大载量为9.12 mg/mL（填料）。更多信息请联系蓝晓科技。5min保留时间，载量≥3mg/ml（填料），与实验条件，样品浓度等有关。

10.3离子交换层析：经过Seplife 6FF和Seplife Plasmidl LX纯化后的scDNA内毒素含量已经很低，再经Seplife LXMS-30Q进一步纯化，将痕量的内毒素去除。

➤推荐平衡缓冲液：0.4M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5

➤推荐洗脱缓冲液：1.0M NaCl，10mM EDTA，100mM Tris-HCl，pH 7.5

结果：经过前2步层析后的scDNA样品经Seplife LXMS-30 Q填料纯化后回收率为94.6%，内毒素含量1.2EU/mg（scDNA)。

➤此工序的离子交换填料Seplife LXMS-30Q也可以尝试用蓝晓科技高刚性高分辨率高回收率多糖材质填料Q Large Scale HP替换，可根据实际情况合理选择。

11. 纯化scDNA在经过超滤伴随洗滤的方式调整浓度及置换缓冲液，再除菌过滤后进入后续制剂或者酶切工序。

3.质粒DNA其它纯化工艺

澄清并浓缩的质粒也可以用4M CaCl2等进行进行盐析，去除RNA，也可以用多模式填料Seplife Suncore 700填料流穿模式去除RNA等杂质，再配合Seplife Plasmidl LX亲和层析或者疏水层析去除ocDNA及内毒素等杂质。