基因与细胞治疗中GMP质粒的大规模生产工艺剖析

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       质粒是一种小型环状超螺旋DNA分子，是目前基因与细胞治疗中最常用、最重要的载体之一，其最终的使命是将目的基因导入靶细胞，以达到治疗或者预防某种疾病的目的。基因与细胞治疗对于载体要求高且用量大，因此质粒载体作为直接导入细胞的载体或者是制备病毒载体的重要原料之一，其纯度、质量及产能是基因和细胞治疗的重要前提之一。尤其临床级质粒载体的大规模生产，除了要满足量上的需求，还要面临质粒DNA的安全性、工艺的稳定性等方面的挑战。

宜明细胞专注于临床级GMP质粒的大规模生产工艺开发，宜明细胞的基因和细胞治疗CDMO平台设有独立的GMP质粒生产车间，拥有成熟的质粒高产量发酵工艺、连续流碱裂解工艺和高效的层析柱纯化工艺（两步法实现高产量高纯度的质粒生产），经过不断地创新和优化，目前已建立完善的平台化工艺、质量控制和质量保证体系，根据客户不同需求可以提供从mg-g级GMP质粒的开发生产，完全满足临床级基因和细胞治疗质粒载体的大规模生产需求。

本文介绍宜明细胞基于两步层析纯化法的GMP质粒大规模生产过程。

一、质粒载体的构建和优化

基因和细胞治疗的质粒载体包括目的质粒载体和辅助质粒载体。质粒载体的选择和优化对质粒DNA的产量和质量至关重要,同时用于临床级质粒DNA生产的载体应该来源清楚，溯源明确。载体抗性的选择同样重要，一般不得使用氨苄抗性，避免使用β内酰胺类抗生素抗性基因。

二、种子库构建

菌种种子批的制备和检定应符合《中国药典》通则“生物制品生产检定用菌种管理规程”的要求，菌种的来源应清晰，制备过程要完整。用于GMP质粒DNA生产的种子应按照相关法规规定建立三级种子库系统（原始库、主种子库和工作种子库）。种子库规模应能满足未来商业化生产需求，并有稳定性数据支持，明确限定传代次数。

在GMP条件下构建主种子库（MCB）和工作种子库（WCB），同时按照《中国药典》进行检定，包括但不限于如下检测：

宜明细胞GMP厂房设有专门的原核细胞库构建车间和单独的储备车间，宜明细胞对菌种库的构建符合中国药典和美国FDA对菌种库构建的要求。截止目前，宜明细胞已经将用于慢病毒及AAV生产的辅助载体按照国家法规的要求，建库、质检完毕，并且来源明晰，可直接用于客户的下游病毒的生产，大大减少工艺开发的时间。

三、发酵和收获

质粒DNA的规模化生产通常是在高密度发酵情况下进行的，通过小试规模得到菌种发酵的基本信息和优化条件后，进行规模的放大。

常用的菌体收获方法有离心法、连续流和切向流过滤法。其中离心法受限于规模放大，耗时耗力，不能满足大规模生产需求。中空纤维柱切向流过滤剪切力低、可以线性放大，在质粒DNA生产中，利用中空纤维柱收集菌体对质粒DNA质量不会造成影响，同时可以满足规模化生产需求。

宜明细胞的发酵规模可以达到200L，拥有成熟的发酵工艺，核心员工拥有10年以上的上游发酵经验，不仅大大缩短工艺开发时间，而且可以大幅度降低成本。

四、下游纯化

◆ 菌体裂解

碱裂解法是最常见的菌体裂解方法，但是裂解时间、pH值、菌体和碱混合均匀程度等因素严重影响着质粒DNA的产量和质量。传统搅拌式裂解工艺用于工业化生产时，存在较多缺陷。裂解时间过长或搅拌的剪切力会导致超螺旋质粒DNA变性开环；而裂解时间不足则不能充分裂解，导致产量降低。同时过度搅拌会导致基因组DNA分子断裂，增加纯化的难度。宜明细胞在连续流裂解工艺上有独有的技术创新，在无需搅拌的情况下实现菌体充分且柔和的裂解，在不损伤DNA结构的前提下，最大限度的提取DNA，该技术参数可控，可线性放大，完全满足商业化生产需求。

◆ 层析法精纯

裂解液经过澄清浓缩后，浓缩后已经去除掉一部分的基因组DNA和蛋白质，但仍然有大量的基因组DNA片段、蛋白、RNA、不同构象的质粒DNA和内毒素等杂质，它们从分子大小、化学性质方面同超螺旋质粒DNA相差不大，是纯化过程中较难去除的成分。大规模质粒DNA精纯的首选方法是层析法，包括离子交换层析、亲和层析、分子排阻层析等，利用目标产物与杂质在分子大小、构象、电荷和疏水性等化学性质、以及与配体结合强弱等方面的差异来分离。

在进行商业化生产时，需要建立高效的层析纯化平台，根据产品特性，合理选择填料和层析方法，经过宜明细胞团队的研发，宜明细胞采用独特的质粒2步层析纯化工艺，在确保最终产品质量与传统三步法一致的情况下，省去三步法中柱体积最大、填料单价最高的分子筛步骤，不仅可以节省大量填料成本，还节省了洁净厂房面积、配液及储液设备、人员及厂房占用时间等可观成本，此外，纯化效率也大大提高。宜明细胞两步法纯化工艺成熟，客户可在短时间内获得所需要的GMP质粒产品，同时目前工艺可实现线性放大，为未来商业化生产提供坚实的技术基础。

五、无菌灌装

临床级质粒DNA，尤其是在直接用于临床的质粒DNA疫苗和直接使用质粒DNA递送基因的基因治疗中，要求质粒DNA生产具有除菌过滤的环节。宜明细胞设计采用C+A级设计标准，在全封闭的绝对A级隔离器中进行无菌灌装，可实现自动记录尘埃粒子、温湿度，同时可以实现全过程录像，全方位符合基因治疗产品的法规要求。

六、放行检测

目前宜明细胞已经完成十余种不同GMP质粒开发、生产，已经完成法规要求的质粒相关的方法学开发工作，可为客户IND提供相关的开发数据，大大降低了客户产品方法学验证的周期。