GMP论坛-中国最大的GMP认证信息交流平台

搜索
查看: 277|回复: 0

全面解析His标签蛋白纯化及金属螯合层析

[复制链接]
  • TA的每日心情
    开心
    3 小时前
  • 140

    主题

    185

    帖子

    6154

    积分

    传播制药技术,促进医药合规, 确保药品安全!

    Rank: 9Rank: 9Rank: 9

    QQ达人论坛元老优秀版主突出贡献论坛达人

    发表于 2022-4-15 23:33:34 来自手机 | 显示全部楼层 |阅读模式
    His-Tag融合蛋白简介
    His-Tag融合蛋白是目前最常见的蛋白表达方式,而且很成熟,它的优点是表达方便且不影响蛋白的活性,无论是可溶性表达或者包涵体都可以用固定金属离子亲和层析(IMAC)纯化。IMAC是Porathetal.1975年用固定IDA作为配基的介质螯合过渡金属铜、镍、钴或锌离子,可以吸附纯化表面带组氨酸、色氨酸或半胱氨酸残基的蛋白。1987年Hochulietal.发现带有相连组氨酸的多肽和Ni2+-NTA介质作用力更强于普通的肽,1988年他第一次用这样的方法纯化了带六个组氨酸标签的多肽,无论是在天然还是变性条件下一次亲和纯化都得到很好效果,此后表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC变得非常普遍,相对而言,不带标签的蛋白纯化就非常困难,所以表达带六个组氨酸标签的蛋白配合IMAC纯化变成最常用而且最有效的研究蛋白结构和功能的有力手段。

    金属螯合层析的分离原理

    mmexport1650036890062.jpg

    组氨酸(His)的残基上带有一个咪唑基团,可以和Ni2+,Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属离子上,这些金属离子能够用螯合配体固定在层析介质上,因此带有组氨酸标签的蛋白在经过装配了金属离子的层析介质时可以选择性的结合在介质上,而其他的杂质蛋白则不能结合或者仅能微弱结合。结合在介质上的HIS标签蛋白可以通过提高缓冲液中的咪唑浓度进行竞争性洗脱,从而得到较高纯度的HIS标签蛋白。

    mmexport1650036925351.jpg

    同时半胱氨酸(Cys)的残基上的巯基,色氨酸(Trp)的残基上的吲哚基也可以Ni2+,Co2+等过渡金属离子形成配位键而选择性的结合在金属螯合介质上。

    经典金属螯合介质
    ➤Ni Seplife FF(IDA)——载量高,高流速,纯化效率,但不适合含有8M尿素及EDTA,DTT的样品纯化。点击下载:Ni螯合高流速琼脂糖微球介质IDA说明书
    ➤Ni Seplife 6FF(NTA)——载量高,耐受性,适合含有8M尿素及6M盐酸胍的样品的纯化。点击下载:Ni螯合高流速琼脂糖微球NTA说明书
    ➤Ni Seplife FF(TED)——耐受性好,可以耐受100mM EDTA,非常适合真核外泌蛋白的纯化。可直接使用NaOH在位清洗,无需脱镍挂镍,省时省力。含有8M尿素及6M盐酸胍的样品用此镍填料影响结合,低丰度的样品结合效率效率差。点击下载:Ni螯合高流速琼脂糖微球介质TED说明书
    ➤Ni Seplife HP(IDA)——小粒径基质使其有更高的分辨率。
    ➤IMAC Seplife FF(IDA)——可以自己鳌合不同的金属离子,适合纯化外露His,Cys,Try  残基的蛋白。
    mmexport1650036980446.jpg

    His-Tag纯化时金属螯合介质的选择

    ➤科研微量制备——Ni Seplife HP(IDA),此填料分辨率高,科研微量制备可用此填料纯化,纯度更高。
    ➤样品中含有DTT或EDTA——Ni Seplife FF(TED),此填料可以耐受100mM的EDTA及10mM的DTT,样品中含有EDTA及DTT时无需换液直接过镍柱纯化。
    ➤样品中含有8M尿素(6M盐酸胍)——Ni Seplife FF(NTA),IDA耐受性差,TED结合力弱,在含有高浓度尿素时结合效率差,所以含有变性剂的样品首选IMAC的镍柱。
    ➤含有Cys/Try残基蛋白——含有Cys/Try  残基的蛋白和镍填料的结合力弱,此时可以选择IMAC Seplife FF(IAD)的填料螯合Cu离子进行亲和纯化(如乌司他丁可用此填料纯化)

    His-Tag融合蛋白纯化常见问题

    1.His标签蛋白不和介质结合

    a可能原因:超声功率不合适(太大,蛋白碳化,太小,蛋白没完全释放)

    解决方法:改变超声功率或者其它方法破碎细胞。

    b.样品或缓冲液不合适

    解决方法:确保缓冲液中螯合剂,还原剂,咪唑浓度不是很高。

    c.His标签暴露不完全

    解决方法:在缓冲液中加变性剂(4-8M尿素,4-6M盐酸胍),然后用IMAC介质纯化。

    d.His标签丢失

    解决方法:必要时增加His的个数并确保正确表达,同时降低上样速度,确保足够的孵育时间。

    2.His标签蛋白结合在介质上洗脱困难

    a.可能原因:洗脱条件太温和

    解决方法:增加洗脱咪唑浓度或降低pH。

    b.可能原因:蛋白沉积在介质上

    解决方法:减少上样量,优化层析条件。

    c.可能原因:非特异性结合

    解决方法:缓冲液加2% Triton X-100和NaCl。

    3.洗脱峰杂质多

    可能原因:非特异性结合,清洗不彻底,降解等。

    解决方法:纯化过程加蛋白抑制剂防止降解,上样完后要彻底清洗,加一定的NaCl和咪唑减少非特异性结合。

    4.使用几次后,介质结合效率降低,柱效降低。

    可能原因:介质上沉积大量杂质等

    解决方法:彻底清洗,IDA/IMAC脱镍再生处理
    传播制药技术,促进医药合规,确保药品安全---GMP论坛-中国最大的GMP认证交流信息平台!
    您需要登录后才可以回帖 登录 | 立即注册

    本版积分规则

    Copyright © 2001-2013 Comsenz Inc.Powered by Discuz!X3.4
    手机触屏版小黑屋GMP论坛
    快速回复 返回顶部 返回列表