基于质量源于设计路线的单抗制品细胞培养工艺研究

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前言

当前，随着国内生物医药的快速发展，越来越多的生物制药企业的产品研发进入产业化阶段。在生物制药领域里，质量源于设计（QbD)是一种系统化、结构化、基于科学和风险的药品研发方法，是一种对产品、工艺和分析方法进行科学有效管理的重要工具。目前单抗领域是生物制药行业发展最快，也是相对成熟的领域之一，关于QbD的在单抗制品的开发中应用的报道越来越多，本文简述了单抗制品细胞培养生产工艺中应用QbD的概念和初步想法。

细胞培养生产工艺

抗体药物的原液生产大体可分为上游工艺（又称细胞培养）、下游工艺（又称纯化）2个环节，每个环节都拥有其核心技术，这些核心技术环环相扣，形成了抗体药物生产企业的核心竞争力。一个典型的单抗药物的商业化生产流程-上游工艺（细胞培养）一般采用以下步骤：细胞复苏与传代→扩增培养→细胞大规模培养→细胞分离（可属于下游工艺）。

01

细胞复苏与传代

将种子放置在恒温的水浴锅中，一般温度控制在如35℃左右，预热如30min，将工作细胞库细胞进行解冻复苏，根据工艺要求控制解冻时间，然后将解冻细胞加入至培养基中，离心分离后转入摇瓶中（如250 mL），进行摇瓶传代。注意控制CO2浓度、培养温度、培养时间等因素，同时也要根据工艺的要求控制接种的密度，控制细胞活率等要求。将上述的复苏种子细胞按照一定的密度稀释至新摇瓶中（如500 mL/2000mL），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、摇床摇摆速度、pH等因素，逐渐扩增细胞数量至满足一级种子罐的接种要求。

02

扩增培养（亦称种子培养）

一级种子培养

将摇瓶种子细胞按照一定的密度接种到一级种子罐内（如20 L），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足二级种子罐的要求。

二级种子培养

将一级种子按照一定的密度接种到二级种子罐内（如50 L），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足三级种子罐的接种要求。

三级种子培养

将二级种子按照一定的密度接种到三级种子罐内（如100 L），控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素，逐渐扩增至细胞数量满足细胞发酵培养的接种要求。

03

细胞大规模培养（亦称生物反应器细胞培养）

种子扩增后要进入细胞大规模培养阶段，注意控制温度、CO2浓度、溶氧浓度、培养温度、培养时间、搅拌速度、pH、培养基等因素。细胞培养结束后，可采用离心分离或澄清过滤等方法进行抗体蛋白的分离纯化。

基于QbD理念的细胞培养工艺开发

质量源于设计（QbD) 核心理念在于“质量是通过科学合理的设计得以实现的，而不是仅仅依靠最终检验出来的”。自2013年起，美国 FDA 对于新的药品批准申请，监管部门均要求采用QbD方法。近年来，QbD的理念已逐渐成为国内企业大多数药品生产和研发企业共识，在单抗制品的细胞培养工艺开发中应用的报道越来越多，基于QbD理念的药品开发基本流程，ICH Q8中提到的质量源于设计QbD的方法如下图所示：

基于QbD理念的细胞培养工艺开发：首先要界定目标产品的质量概况（QTPP），即以预先设定的目标产品质量概括（QTPP）为研发的起点，在了解关键物质属性（CMA）的基础上，通过试验设计（DOE），理解产品的关键质量属性（CQA），确立关键工艺参数（CPP），在原料特性、工艺条件、环境等多个影响因素下，建立能满足产品性能的且工艺稳健的设计空间（DS），并根据设计空间，建立质量风险管理，确立质量控制策略和药品质量体系，整个过程强调对产品和生产的认识。QbD可以帮助我们更好地理解产品和工艺，增强单抗制品的稳定性，降低GMP生产的复杂性和成本等。

那么细胞培养过程中设计空间如何确定一直是大家都感兴趣的话题，自从2021年6月25日，CDE发布实施《已上市生物制品药学变更研究技术指导原则（试行）》，正式在官方指导原则提到设计空间的概念，一石激起千层浪，下面我就来分享一下细胞培养过程中设计空间确定的流程，因为个人认知的局限性，如有不足，欢迎留言补充。细胞培养操作空间一般由申办者在注册时提出，监管机构（如CDE）评估和批准，在设计空间的确定过程中，需要量化不同参数对工艺过程产品表现的影响：如产量和质量，按影响程度通常分为非重要工艺参数（Non-KPP），重要工艺参数（KPP）、关键工艺参数（CPP），细胞培养过程中设计空间（DS）确定流程一般如下（可供参考），

01

评估细胞培养过程中所有工艺过程参数

首先以适当的评估工具（如FMEA）评估细胞培养过程中所有工艺过程参数，确定细胞培养工艺表征中需要研究的参数，因不同生物制品自身特点不同，细胞培养过程中工艺过程参数也会有所差别，评估后的工艺表征中需要研究的参数也会有所差别。因此相关研究人员须具备足够的培养工艺知识积累、风险评估和风险管控的能力。在实施评估时，基于风险，前瞻性设计研究方案，开展充分的研究，不同阶段细胞培养，评估的参数对象也会有所差别，一般情况下分细胞复苏与传代、各级种子培养、细胞大规模培养分别进行评估细胞培养过程相关工艺过程参数，如某药企大规模生产阶段细胞培养过程相关工艺过程参数如下表：

02

建立工艺缩小模型

其次建立工艺缩小模型；在缩小模型基础上，进行试验设计（DOE）参数筛选实验，去除非重要工艺参数（Non-KPP），确定重要工艺参数（KPP），对影响产品质量的参数进行响应曲面设计（RSM）实验设计，建模，确定关键工艺参数（CPP）操作空间，如在风险评估阶段确定了生产培养步骤中的4个潜在的关键工艺参数（CPP）(IVCD、Culture duration、pH和Temperature)，最后进行最差条件实验进行操作空间确认，确认的范围如下表：

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